微生物菌种冻干操作流程

      

     冻干机适用于大多数细菌、放线菌、病毒、噬菌体、立克次体、霉菌和酵母等的真空冷冻干燥保藏，但不适于霉菌的菌丝型、菇类、藻类和原虫等。其操作流程如下：

1、安瓿管准备

     安瓿管材料以中性玻璃为宜。清洗安瓿管时，先用2%盐酸浸泡过夜，自来水冲洗干净后，用蒸馏水浸泡至pH中性，干燥后、贴上标签，标上菌号及时间，加入脱脂棉塞后，121℃下高压灭菌15-20分钟，备用。

2、保护剂的选择和准备

     保护剂种类要根据微生物类别选择。配制保护剂时，应注意其浓度及pH值，以及灭菌方法。如血清，可用过滤灭菌；牛奶要先脱脂，用离心方法去除上层油脂，一般在100℃间歇煮沸2-3次，每次10-30分钟，备用。

3、冻干样品的准备

     在zui适宜的培养条件下将细胞培养至静止期或成熟期，进行纯度检查后（参见科技部自然科技资源平台联合管理办公室文件《微生物菌种纯度检测技术规程》（试行）），与保护剂混合均匀，分装。微生物培养物浓度以细胞或孢子不少于108-1010个/ml为宜（以大肠杆菌为例，为了取得每毫升1010个活细胞菌液2毫升-2.5毫升，只需10毫升琼脂斜面两支）。采用较长的毛细滴管，直接滴入安瓿管底部，注意不要溅污上部管壁，每管分装量约0.1-0.2毫升，若是球形安瓿管，装量为半个球部。若是液体培养的微生物，应离心去除培养基，然后将培养物与保护剂混匀，再分装于安瓿管中。分装安瓿管时间尽量要短，在1-2小时内分装完毕并预冻。分装时应注意在无菌条件下操作。

4、预冻

    一般预冻2小时以上，温度达到-20℃到-35℃左右。

5、冷冻干燥

   采用冷冻干燥机进行冷冻干燥。将冷冻后的样品安瓿管置于冷冻干燥机的干燥箱内，开始冷冻干燥，时间一般为8-20小时。

终止干燥时间应根据下列情况判断：

——  安瓿管内冻干物呈酥块状或松散片状

——  真空度接近空载时的zui高值

——  样品温度与管外温度接近

——  选用1-2支对照管，其水份与菌悬液同量，视为干燥完结

——  选用一个安瓿管，装1-2%氯化钴，如变深兰色，可视为干燥完结

冷冻干燥完毕后，取出样品安瓿管置于干燥器内，备用。

6、真空封口及真空检验

     将安瓿管颈部用强火焰拉细，然后采用真空泵抽真空，在真空条件下将安瓿管颈部加热熔封。

     熔封后的干燥管可采用高频电火花真空测定仪测定真空度。

7、保藏

     安瓿管应低温避光保藏。

8、质量检查

    冷冻干燥后抽取若干支安瓿管进行各项指标检查，如存活率、生产能力、形态变异、杂菌污染等。